Diseño de un sistema pet-pcr in house para el diagnóstico molecular de plasmodium falciparum y plamodium vivax

Abstract

Por muchas décadas el diagnóstico de la malaria, enfermedad causada por el protozoario Plasmodium spp., ha estado y sigue basado en el análisis microscópico de la gota gruesa. En el contexto del plan de fase hacia la eliminación de la Malaria, es importante detectar y tratar la malaria asintomática y subpatente para lo cual se requiere implementar nuevas herramientas diagnosticas como los sistemas de técnica molecular que permitan una alta sensibilidad y así eliminar los reservorios de la enfermedad. Con este fin, se desarrolló un sistema de amplificación PET (Photo-Induced Electron Transfer) PCR para comparar con otras plataformas molecular y determinar su sensibilidad y especificidad analítica. Se diseñaron cebadores específicos usando como genes de referencia PFr364 y Pvr47 para detectar Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax, respectivamente. Se estandarizó las condiciones de amplificación para determinar la temperatura de alineamiento y la concentración de cebadores a usar. Así mismo, se evaluaron diferentes parámetros como el rango dinámico de amplificación, el límite de cuantificación, el límite de detección, la especificidad analítica, la repetitividad y reproducibilidad para métodos cuantitativos, tanto en sistema singleplex como en multiplex. Finalmente, se evaluó un grupo de muestras, previamente analizados por gota gruesa y qPCR SybrGreen, comparando los resultados obtenidos. En comparación con el sistema qPCR en SybrGreen, el sistema PET-multiplex permite la detección de P. falciparum y P. vivax indistintamente, sin el uso de herramientas adicionales como temperatura de melting, permitiendo la identificación de infecciones mixtas. Así el sistema PET permite la detección de infecciones menores a 1 parásito/ μl, encontrándose en el rango de infecciones submicroscópicas.