Optimización de la técnica PCR-ELISA para la detección de la resistencia a Rifampicina en Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Introducción: La tuberculosis es una enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis. Este bacilo ha mostrado resistencia a los fármacos antituberculosis, principalmente Rifampicina (RIF) e Isoniacida (INH), generando un problema de salud pública en nuestro país. La necesidad de utilizar técnicas moleculares, como el PCR-ELISA, permitirá detectar la resistencia a RIF de forma rápida, sencilla y económica. Objetivo: Optimizar un PCR-ELISA para detectar la resistencia a RIF en muestras de pacientes con tuberculosis. Método: Se estandarizó un PCR-ELISA para amplificar una región del gen rpoB de 255pb que codifica la resistencia a RIF. Se optimizaron diferentes parámetros: temperaturas de hibridación, diferentes astringencias del buffer de hibridación, concentración de sonda entre otros. Se evaluó la sensibilidad, la especificidad y la concordancia del PCR-ELISA frente al GenotypeMDRTBplus utilizando 20 muestras en un ensayo piloto. Resultados: Se optimizo un PCR-ELISA para la detección de las mutaciones H445D, H445Y y S450L que confieren resistencia a RIF, lográndose un límite de detección de 400 pg para las sondas H445D y H445Y y de 40pg para la sonda S450L. El PCR-ELISA tiene una especificidad del 100% únicamente para Mycobacterium tuberculosis y una sensibilidad de 86.7%. Se encontraron 2 mutaciones S450W y L452P, que no fueron detectadas por el sistema. En el ensayo piloto se obtuvo una “concordancia buena” (k=0.737) entre el GenotypeMDRTBplus y el PCR-ELISA. Conclusiones: Se estandarizó un PCR-ELISA para la detección de las 3 mutaciones más frecuentes en el Perú asociadas a la resistencia a RIF de manera simultánea, siendo la más frecuente la S450L.