caratula_tesis Medina Palomino, Elizabeth Patricia.docx FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA EFICACIA DE LA UTILIZACIÓN DE LA INMUNOCITOQUÍMICA PARA EL DIAGNÓSTICO Y/O TIPIFICACIÓN DE ENFERMEDADES NEOPLÁSICAS SOBRE FROTICES CITOLÓGICOS EN EL INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES NEOPLÁSICAS EN LOS AÑOS 2017 – 2018 Línea de investigación: Biología Celular y Molecular Trabajo Académico para obtener el Título de Segunda Especialidad en Genética y Biología Molecular Autora: Huamanciza Ostos, Yolanda Eugenia Asesor: Salas Asencios, Ramsés ORCID: 000-0002-4075-1736 Jurado: Saez Flores, Gloria María Rodrigo Rojas, María Elena Bohorquez Meza, Isabel Doris Lima - Perú 2022 Referencia: Huamanciza, O. (2022). Eficacia de la utilización de la inmunocitoquimica para el diagnóstico y/o tipificación de enfermedades neoplásicas sobre frotices citológicos en el instituto nacional de enfermedades neoplásicas en los años 2017-2018 [Tesis de pregrado, Universidad Nacional Federico Villarreal]. Repositorio Institucional UNFV. http://repositorio.unfv.edu.pe/handle/UNFV/5941 Reconocimiento - No comercial - Sin obra derivada (CC BY-NC-ND) El autor sólo permite que se pueda descargar esta obra y compartirla con otras personas, siempre que se reconozca su autoría, pero no se puede generar obras derivadas ni se puede utilizar comercialmente. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA EFICACIA DE LA UTILIZACIÓN DE LA INMUNOCITOQUÍMICA PARA EL DIAGNÓSTICO Y/O TIPIFICACIÓN DE ENFERMEDADES NEOPLÁSICAS SOBRE FROTICES CITOLÓGICOS EN EL INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES NEOPLÁSICAS EN LOS AÑOS 2017 – 2018 Línea de Investigación: Biología Celular y Molecular Trabajo Académico para obtener el Título de Segunda Especialidad en Genética y Biología Molecular Autora: Huamanciza Ostos, Yolanda Eugenia. Asesor: Salas Asencios, Ramsés ORCID: 000-0002-4075-1736. Jurado: Saez Flores, Gloria María Rodrigo Rojas, María Elena Bohorquez Meza, Isabel Doris Lima – Perú 2022 2 Dedicatoria A mi amada hija Alexandra, fuente de toda mi inspiración. A mi amado esposo Luis, mi compañero desde la universidad y ahora de toda la vida. A mi amada madre Yolanda, mi ejemplo de vida. 3 ÍNDICE RESUMEN ................................................................................................................................ 4 ABSTRACT ............................................................................................................................... 5 I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 6 1.1. Descripción del problema................................................................................................ 7 1.2. Antecedentes ................................................................................................................... 8 1.3. Objetivos ....................................................................................................................... 11 1.4. Justificación ................................................................................................................... 12 1.5. Impactos esperados del proyecto................................................................................... 12 II. METODOLOGÍA ............................................................................................................... 14 2.1. Género y edad del paciente en estudio .......................................................................... 14 2.2. Tipo de material citológico ........................................................................................... 16 2.3. Preparación citológica ................................................................................................... 18 2.4. Inmunocitoquímica........................................................................................................ 20 2.5. Cuantificación del resultado inmunohistoquímico ........................................................ 23 III. RESULTADOS.................................................................................................................. 24 IV. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 26 V. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 27 VI. REFERENCIAS ................................................................................................................ 28 VII. ANEXOS .......................................................................................................................... 31 4 RESUMEN Introducción: La detección temprana de las distintas neoplasias es uno de los objetivos principales de la Unidad Funcional de Citopatología del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas. Se realiza mediante el análisis microscópico de los frotices citológicos de pacientes provenientes de Lima y diferentes regiones del país que acuden a nuestro Instituto para realizar el posterior diagnóstico y tratamiento del paciente. Una de las limitaciones es la escasez del material citológico colectado a través de las diferentes técnicas de obtención celular: biopsias por aspiración con aguja fina (BAAF), técnica de Papanicolaou, extracción de líquidos corporales, expectoraciones, etc. La técnica de inmunocitoquímica (ICQ) es de gran especificidad y alta sensibilidad para la detección de células neoplásicas mediante la interacción antígeno-anticuerpo, permitiendo identificar eficazmente moléculas en ínfimas cantidades en las células. Objetivo: Evaluar la eficacia del uso de técnicas como la ICQ para casos de frotices citológicos con sospecha de malignidad y sin otro tipo de material citológico que aporte elementos para un diagnóstico preciso. Métodos: Revisión de la base de datos del Laboratorio de Citología con resultados del sistema de visualización EnVision™ FLEX mini Kit, High pH (Dako Omnis), indicado para realizar ICQ con los instrumentos Dako Omnis. Conclusión: De los 304 casos con sospecha de malignidad, se pudo establecer la positividad en 244 (80.26%), la negatividad en 30 casos (9.87%) y 30 casos (9.87%) quedaron como sospechosos de malignidad. Palabras clave: Inmunocitoquímica, biopsia por aspiración, citología, frotis citológico y anticuerpos. 5 ABSTRACT Introduction: The early detection of different neoplasms is one of the main objectives of the Cytopathology Functional Unit of the National Institute of Neoplastic Diseases. It is performed by microscopic analysis of the cytological smears of patients from Lima and different regions of the country who come to our Institute to carry out the subsequent diagnosis and treatment of the patient. One of the limitations is the scarcity of cytological material collected through the different cell collection techniques: fine-needle aspiration biopsies (FNAB), Pap smear technique, extraction of body fluids, expectorations, etc. The immunocytochemical technique (ICQ) is highly specific and highly sensitive for the detection of neoplastic cells through antigen-antibody interaction, allowing efficient identification of molecules in minute quantities in cells. Objective: To evaluate the efficacy of the use of techniques such as ICQ for cases of cytological smears with suspicion of malignancy and without other types of cytological material that provide elements for an accurate diagnosis. Methods: Review of the Cytology Laboratory database with results from the EnVision™ FLEX mini Kit, High pH (Dako Omnis) visualization system, indicated to perform ICQ with Dako Omnis instruments. Conclusion: Of the 304 cases with suspected malignancy, positivity could be established in 244 (80.26%), negativity in 30 cases (9.87%) and 30 cases (9.87%) were suspected of malignancy. Keywords: Immunocytochemistry, aspiration biopsy, cytology, cytological smear and antibodies. 6 I. INTRODUCCIÓN En la Unidad Funcional de Citopatología del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas - INEN se realiza el diagnóstico de diversas enfermedades neoplásicas a partir de material citológico procedente de diferentes órganos del cuerpo. Se utilizan técnicas variadas para su obtención como biopsias por aspiración con aguja fina (BAAF), técnica de Papanicolaou, extracción de líquidos corporales, expectoraciones, etc. Estas metodologías permiten obtener un diagnóstico rápido, efectivo y de costo beneficio para pacientes de bajos recursos, asimismo en el caso de las BAAF se puede obtener material citológico de órganos con difícil acceso para una biopsia convencional. (Koss,1988, Orell et al,1999). El tipo de material citológico que se deriva de estas técnicas es el frotis celular, en el cual se coloca el material citológico mediante frotis sobre una lámina de vidrio (porta objeto), se fija, se colorea, se prepara para montaje y se observa al microscopio óptico. También se puede obtener el bloque celular y/o coágulo, que son sometidos al proceso de fijación, parafinización, corte histológico, se coloca en la lámina porta objetos, coloración, deshidratación, se procede al montaje para su posterior lectura al microscopio óptico. Alwahaibi menciona que el frotis citológico y el bloque celular (CB) se utilizan de forma rutinaria para diagnosticar muestras no ginecológicas. Sin embargo, existe escasa información en la literatura para comparar el frotis citológico y CB con las correspondientes biopsias de tejido. Este estudio tiene como objetivo evaluar la precisión del frotis citológico y CB en el diagnóstico de tumores malignos en muestras no ginecológicas. (Alwahaibi et al, 2018). En estos casos en los que la coloración citológica no vislumbra un diagnóstico preciso, es de gran importancia la realización de técnicas de inmunocitoquímica (ICQ) para conseguir este objetivo. La ICQ es una técnica de gran especificidad y alta afinidad y que permite identificar 7 moléculas en ínfimas cantidades en las células, mediante el uso de anticuerpos, para descartar si existe o no neoplasia (Brahmi et al, 2001), así como para tipificarla, beneficiando el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad (Dalquen et al,1993). De los diversos métodos de prueba de biomarcadores predictivos, la inmunocitoquímica (ICQ) es común, rentable, y fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios, tiene un tiempo de respuesta rápido, se puede realizar en relativamente todas las células tumorales y plantea la menor cantidad de técnica desafíos en comparación con otros métodos moleculares y de citogenética (Roy- Chowdhuri, 2020). Aunque aproximadamente el 51% y el 75% de los laboratorios de citología en los Estados Unidos y Europa, respectivamente, informó el uso de preparaciones sin CB para el diagnóstico de ICQ en encuestas de 6 a 7 años atrás, su uso para ICQ probablemente ha disminuido más recientemente, particularmente en Estados Unidos, donde los laboratorios comerciales no aceptan frotis para ICQ (Jain et al, 2019). Mandal et al. en 2013, trabajaron en 78 casos confirmados por histopatología e inmunohistoquímica. De 36 casos citológicos que hubo, 30 casos se correlacionaron histológicamente. Los seis casos incorrectos se debieron a material inadecuado en los frotis (tres casos) o a la tinción falsa positiva (tres casos). En el INEN esta técnica de ICQ es utilizada de manera rutinaria sobre muestras de tejidos y sobre bloques y/o coágulos, así como en muestras citológicas cuando el caso lo amerita. 1.1. Descripción del problema El uso de técnicas inmunológicas en citología se expandió rápidamente durante los últimos 20 años. Situación similar ha llevado a histopatología a un aumento en la precisión diagnóstica. Además, las características de las células tumorales que determinan la sensibilidad a las terapias 8 dirigidas también se pueden definir en el material citológico (Skoog y Tani, 2011), así se han evaluado los casos analizados en el año 2017 y 2018, en el servicio de Citopatología del INEN, sobre frotices citológicos en los que se ha realizado la ICQ, para poder dar respuesta a lo siguiente: ¿Es eficaz la técnica de inmunocitoquímica para el diagnóstico y tipificación de las enfermedades neoplásicas realizados sobre frotices citológicos con sospecha de neoplasia, no contando con bloque celular y/o coágulo como respaldo? 1.2. Antecedentes El cáncer constituye un problema de salud pública a nivel mundial y en nuestro país, por su alta mortalidad y por la discapacidad que produce (MINSA, Programa presupuestal 2017), es que los profesionales de la salud tienen como objetivo la detección temprana de las neoplasias, su diagnóstico definitivo, tratamiento y pronóstico. Muchos de estos diagnósticos dependen del estudio citológico que se realiza sobre las células o grupos celulares que se encuentran en las muestras tomadas. Los alcances de estos estudios datan del siglo XIX y mitad del XX con la citología exfoliativa (Papanicolaou, 1960) y la biopsia por aspiración con aguja fina (BAAF) que tiene mayor popularidad por los años 60 en adelante (Koss, 1988), con la gran ventaja de ser rápida, eficaz y de atención ambulatoria permitiendo un mayor costo beneficio para el paciente, gracias a que puede llegar prácticamente a cualquier lugar del cuerpo, complementada con guía ecográfica, tomografía axial computarizada (TAC), etc., obteniéndose el diagnóstico con certeza y evitando muchas veces realizar una biopsia quirúrgica (Risberg et al. 1999). Así, la interpretación citológica se basa en la identificación de la disposición y tamaño de las células y/o grupos celulares, además de la citomorfología del núcleo y el citoplasma; teniendo una valoración de exactitud de entre 80 a 100% según el órgano estudiado y la 9 experiencia del citopatólogo (Bibbo, 1996). Sin embargo, muchas veces se tiene que hacer uso de técnicas complementarias para los casos de diagnóstico diferenciales o en casos de sospecha de enfermedad por métodos convencionales. Un obstáculo importante en la estandarización y el despliegue masivo de ICQ es la gran variabilidad en los tipos de preparaciones citológicas encontradas en laboratorios alrededor el mundo. Los laboratorios de citopatología pueden recibir portaobjetos previamente preparados en forma de frotices secados al aire o fijas, frotis preparados por el médico ordenante. Aspectos singulares de los frotices citológicos y los tipos de preparación variables son claramente factores limitantes para el desempeño de ICQ confiable y consistente. Las distintas preparaciones citológicas también restringen el uso de anticuerpos (Dupré, 2012) En nuestro país, el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas es el ente rector en materia oncológica, atendiendo a pacientes de diferentes partes del territorio, tanto para despistaje como con diagnóstico oncológico previo. En la Unidad Funcional de Citopatología del INEN, en el año 2017 se atendieron 30,382 casos de pacientes. (Tabla 1 y Gráfico 1). De estos 30,382 casos, 915 casos (18.8%) fueron sometidos a la técnica de ICQ a los frotices y/o IHQ a los bloques celulares y/o coágulos para ayuda diagnóstica (Tabla 2). En el año 2018 se atendieron 22,299 casos de pacientes. (Tabla 1 y Figura 1). Del mismo modo de los 22,299 casos, a 909 casos se les realizó ICQ, a los frotices y/o IHQ a los bloques celulares y/o coágulos (Tabla 2). Lamentablemente en estos materiales citológicos obtenidas por los diferentes métodos solo se pudieron contar con los frotices citológicos debido la escasez de la muestra o porque los coágulos y/o bloques celulares no fueron contributorios (hematíes, necrosis etc.). 10 Por anteriores reportes se ha podido evidenciar que la aplicación de la ICQ sobre frotices citológicos ha dado buenos resultados (Arias-Stella et al, 2003). Tabla 1 Número de casos recibidos en la Unidad Funcional de Citopatología – INEN en el período 2017-2018 Tipo de material citológico 2017 2018 2017 - 2018 No cérvico vaginal y líquidos 3242 3090 6332 Biopsia por aspiración de aguja fina 1138 1318 2456 Informe de lamina 463 457 920 Cérvico vaginal 17778 17008 34786 Vaginal comunitaria 6776 144 6920 Control calidad cervix 985 282 1267 Total 30382 22299 52681 Nota. Tomado de Unidad Funcional de Citopatología del INEN Figura 1 Casos recibidos en la Unidad Funcional de Citopatología – INEN en el período 2017-2018 VAGINAL COMUNITARIA 2018 2017 NO CERVICO VAGINAL Y LIQUIDOS INFORME DE LAMINA Suma de 2018 CONTROL CALIDAD Suma de 2017 CERVICO VAGINAL BIOPSIA POR ASPIRACION DE AGUJA FINA 0 4000 8000 12000 16000 20000 11 Tabla 2 Número de casos procesadas por ICQ en la Unidad Funcional de Citopatología – INEN en el período 2017-2018 Inmunocitoquímica e inmunohistoquímica 2017 2018 2017 - 2018 Inmunocitoquímica e inmunohistoquímica 693 827 1520 Inmunocitoquímica 222 82 304 IHQ Total 915 909 1824 Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN En nuestro laboratorio, en el año 2017 de los 915 casos para Inmunohistoquímica se les realizó solo ICQ a 222 casos por qué no se contó con bloque celular, ni coágulo. Por la misma razón, en el año 2018 de 909 casos se realizó únicamente ICQ a 82 casos (Tabla 2). En estos casos específicos hemos procedido a evaluar la eficacia de esta técnica de ICQ para obtener el diagnóstico preciso en citología en el INEN. 1.3. Objetivos 1.3.1. Objetivo general Evaluar la eficacia de la utilización de la inmunocitoquímica sobre frotices citológicos ya teñidos previamente con sospecha de malignidad, para descartar neoplasias. 1.3.2. Objetivos específicos Aplicar técnicas de detección altamente específicas sobre frotices citológicos escasos para poder obtener el diagnóstico preciso de la neoplasia en pacientes del INEN. Determinar la estirpe celular mediante la tipificación de las células a través de la inmunocitoquímica en pacientes del INEN. 12 1.4. Justificación La técnica de ICQ permite aprovechar los frotices procesados para citología convencional, a pesar de la escasa cantidad de células, para obtener un diagnóstico preciso de la enfermedad a pesar de no contar con bloque celular y/o coágulo. Asimismo, hallar el diagnóstico y la posible tipificación de la enfermedad neoplásica a través de una técnica tan específica y sensible como la inmunocitoquímica en los frotices citológicos utilizando paneles específicos de anticuerpos. El empleo de ICQ permite realizar el diagnóstico diferencial de la muestra en casos de células atípicas con sospecha de neoplasia, por ejemplo: células mesoteliales reactivas versus neoplasia maligna, neoplasias indiferenciadas, linfomas versus carcinoma de células pequeñas, etc., además, la obtención del frotis citológico y el procesamiento son rápidos y eficaces comparado con un procesamiento histológico con parafinización. De esta manera, su realización es de mayor costo-beneficio para el paciente y la institución, evitando en muchos casos realizar procedimientos invasivos para la obtención de un diagnóstico preciso. Finalmente se debe resaltar su importancia en la búsqueda de este diagnóstico preciso y confiable para el paciente, cuya utilidad clínica radica en un tratamiento adecuado y pronóstico claro del transcurso de la enfermedad. 1.5. Impactos esperados del proyecto 1.5.1. Impacto económico Es la primera toma de material citológico que se realiza al paciente, que servirá para realizar los métodos citológicos y moleculares que permitan la obtención del diagnóstico adecuado de la enfermedad. 13 1.5.2. Impacto metodológico El frotis citológico convencional teñido con la técnica de coloración Hematoxilina Eosina o la técnica de coloración Papanicolaou es decolorado y sometido a la técnica de inmunocitoquímica, que permite identificar el antígeno específico para la tipificación de la neoplasia, es decir su estirpe celular. 1.5.3. Impacto social Las técnicas citológicas se realizan masivamente, al no ser invasivas no requieran la implementación de equipos o ambientes diferentes reduciendo el costo en comparación con técnicas histológicas, lo que permite que una gran cantidad de pacientes de bajos recursos puedan acceder a diagnósticos precisos en menor tiempo y ser tratados adecuadamente. 14 II. METODOLOGÍA 2.1. Género y edad del paciente en estudio Fueron 217 (71.4%) pacientes mujeres y 87 (28.6%) pacientes hombres (Tabla 3 y Figura 2), con edades entre 3 y 86 años en el 2017 y entre 2 a 99 años en el 2018 (Tabla 4 y Figura 3). Tabla 3 Género de los pacientes en estudio Pacientes en estudio 2017 2018 2017 - 2018 Mujeres 156 61 217 Hombres 66 21 87 Total 222 82 304 Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN Figura 2 Porcentaje según género de los pacientes en estudio PACIENTES EN ESTUDIO 29% MUJERES 1 VARONES 2 71% Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN. 15 Se analizó la data elaborada en la Unidad Funcional de Citopatología del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas de los años 2017 – 2018 de pacientes ingresados al Departamento de Patología, Laboratorio de Citopatología. Tabla 4 Rango de edades de los pacientes en estudio Edades (Años) 2017 2018 2017 - 2018 1-10 4 2 6 11-20 6 1 7 21-30 12 5 17 31-40 17 7 24 41-50 33 13 46 51-60 56 27 83 61-70 51 18 69 71-80 38 5 43 81-90 5 2 7 91-100 0 2 2 Total 222 82 304 Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN. Figura 3 Rango de edades de los pacientes en estudio RANGO DE EDADES 100 80 60 40 20 0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 2017 - 2018 Nota. Imagen tomada de Unidad Funcional de Citopatología del INEN. 16 2.2. Tipo de material citológico El material citológico que llegó a la Unidad Funcional de Citopatología durante los años 2017 y 2018 fueron muy variadas y se muestran en la Tabla 1. Se realizó inmunohistoquímica e inmunocitoquímica a 1824 casos (Tabla 2) de las cuales 304 son el objetivo de nuestro trabajo. Estos 304 casos fueron provenientes de pacientes que acudieron a los consultorios de Cabeza y Cuello, Senos Huesos y Tumores Mixtos, Radiología, Ginecología, Abdomen del INEN, entre otros, y se les tomaron frotices citológicos mediante BAAF o métodos radiológicos (Tabla 5). Tabla 5 Tipos de citología en estudio Citología en estudio 2017 2018 2017 - 2018 Citología no cérvico-vaginal y líquidos 69 12 81 BAAF 137 70 207 Informe de lámina (IL) 15 0 15 Cervix (IL) 1 0 1 Total 222 82 304 Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN De distintas partes del cuerpo: ganglios cervicales, tiroides, hígado, pulmón, retroperitoneo, mediastino, parótida, axila, mama, páncreas, ovario, vesícula biliar, riñón, cérvix, bazo, colédoco, duodeno, etc., material citológico de líquidos corporales como líquidos peritoneales, ascíticos, pleurales, secreciones corporales como aspirados y cepillados bronquiales etc. e informes de láminas de casos realizados en otros nosocomios. (Tabla 6, Figura 4) 17 Tabla 6 Porcentaje de los tipos de material citológico Tipo de material citológico 2017 2018 2017-2018 % ASPIRADO BRONQUIAL 2 0 2 0.66 AXILA 2 0 2 0.66 BAZO 1 0 1 0.33 BRAZO 0 1 1 0.33 CEPILLADO BRONQUIAL 4 0 4 1.32 CERVIX 1 0 1 0.33 COLEDOCO 1 0 1 0.33 DUODENO 1 0 1 0.33 ESPUTO 1 0 1 0.33 GANGLIO 23 11 34 11.18 GANGLIO AXILAR 6 3 9 2.96 GANGLIO CERVICAL 45 21 66 21.71 GANGLIO INGUINAL 13 6 19 6.25 GLUTEO 0 1 1 0.33 HIGADO 18 3 21 6.91 LARINGE 1 0 1 0.33 LIQUIDOS 13 5 18 5.92 MALAR DER 0 1 1 0.33 MAMA 3 0 3 0.99 MEDIASTINO 4 0 4 1.32 MUSLO D 0 1 1 0.33 NODULOS 33 7 40 13.16 OVARIO 1 0 1 0.33 PANCREAS 3 1 4 1.32 PARED VESICAL 1 0 1 0.33 PAROTIDA 3 1 4 1.32 PARPADO 0 1 1 0.33 PULMON 17 4 21 6.91 TIROIDES 19 12 31 10.20 VESIC BILIAR 1 0 1 0.33 RETROPERITONEO 4 0 4 1.32 RIÑON IZQ 1 0 1 0.33 SENO MAXILAR IZQ 0 1 1 0.33 T CAV ORAL 0 1 1 0.33 T ORBITARIO D 0 1 1 0.33 Total 222 82 304 100.00 Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN 18 Figura 4 Origen del material citológico para inmunocitoquímica de estudio Origen de las muestras para IHQ 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 Origen 2.3. Preparación citológica Todos los frotices celulares que fueron obtenidos de la toma de material citológico, se procesaron con tinción convencional (Figura 5 a y b) de Hematoxilina-Eosina (Anexo A) y/o Papanicolaou (Anexo B) y en algunas muestras salieron bloques celulares o coágulos, a los cuales se les realizó la parafinización para su posterior corte histológico (lamentablemente fueron insuficientes y/o necróticas). % 19 Figura 5 Tinción convencional a) b) Nota. Tomado de la Unidad Funcional de Citopatología del INEN Estos procedimientos se llevaron a cabo en la Unidad Funcional de Citopatología, Departamento de Patología del INEN. Los frotices celulares fueron revisados primeramente por los citólogos y las células sospechosas de malignidad fueron marcadas con plumón indeleble. Posteriormente fueron diagnosticadas por los citopatólogos como sospechosas de malignidad (Figura 6 a y b). 20 Figura 6 Revisión microscópica y marcación de los frotices celulares en las láminas portaobjetos. a) b) . Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN 2.4. Inmunocitoquímica Antes de realizar la inmunocitoquímica se procedió a marcar la lámina frotis con un lápiz punta diamante, las áreas en las que se encontraban las células sospechosas de neoplasia revisadas citológicamente, luego se decoloran las células mediante la técnica de retroprocesamiento citólogico que consiste en retroceder los pasos de coloración desde el xilol hasta antes de la hematoxilina. 21 Para la inmunocitoquimica se utilizó el sistema de visualización EnVision™ FLEX mini Kit, High pH (Dako Omnis) que está indicado para su uso en inmunohistoquímica junto con los instrumentos Dako Omnis. Este sistema detecta anticuerpos primarios de ratón y conejo que hacen reacción con los antígenos y la reacción se visualiza mediante el EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen. (Folleto Dako P04120ES_001_GV800/2015.05 p. 3/12). Figura 7 Procesamiento inmunocitoquímico a) b) Nota. Tomado de: Departamento de Patología del INEN Este sistema de visualización EnVision™ FLEX se utiliza con el sistema Dako Omnis (Fig. 7 a y b) porque el protocolo EnVision™ FLEX está programado previamente en el software de Dako Omnis en combinación con los anticuerpos primarios Dako. Es un procedimiento automatizado de Dako Omnis donde el procesamiento al material citológico se inicia con la recuperación del epítopo inducida por calor (block cell y/o coágulos, frotices citológicos no amerita), seguido de la tinción inmunocitoquímica (Anexo C) y la contratinción posterior con hematoxilina en la lámina. Los pasos del protocolo para los procedimientos automatizados se realizan basados en la Guía del usuario avanzado y el Manual básico del usuario de Dako Omnis (Dako Folleto, 2015) (Anexo D). El procedimiento previo al tratamiento y el protocolo de tinción depende del anticuerpo. Los citopatólogos indican el panel de anticuerpos a procesar para cada caso. 22 Estos fueron los anticuerpos utilizados en Inmunocitoquímica en el INEN para los casos presentados en este trabajo (Tabla 7) Tabla 7 Patrones de tinción ANTICUERPO PATRON DE TINCION BLANCO CD45 (ACL) Membrana Amígdala, cerebro, médula ósea ACTINA Citoplasma Apéndice/Colon, Bazo, Lengua Alfa Feto Proteína Citoplasma Hígado fetal, carcinoma embrionario CA125 Membrana y citoplasma Trompa de Falopio CALCITONINA Calcitonina Tiroides CALRETININA Núcleo y Citoplasma Apéndice/ colon CD10 Membrana Amígdala, hígado CD117 Citoplasma leucemia mielógena crónica CD138 Membrana Amígdala, apéndice/ colón CD15 Membrana y citoplasma Amígdala, hígado, ganglio linfático/ linfoma de Hodking CD1a Membrana y citoplasma Amígdala, piel y timo CD20 Membrana Amígdala CD3 Membrana y citoplasma Amígdala CD30 Membrana y citoplasma Célula Reed Sternberg, linfomas CD68 Citoplasma Amígdala, cerebro CD7 Membrana Amígdala, apéndice/ colon CD79 Membrana y citoplasma Amígdala CD99 (MIC2) Membrana y citoplasma Páncreas, amígdala, timo CDX-2 Núcleo Apéndice y páncreas Antígeno Membrana y citoplasma Hígado y páncreas carcinoembrionario (CEA) CERB-2 Núcleo y citoplasma Cáncer de mama CITOKERATINA 34BE12 Citoplasma Amígdala, próstata CK20 Citoplasma Apéndice/ colon CK7 Citoplasma Páncreas CROMOGRANINA A Citoplasma Apéndice/ colon, cerebro CYCLIN D1 Núcleo Amígdala DESMINA Citoplasma Apéndice/ colon, músculo estriado EBV (LMP-1) Membrana y citoplasma Linfoma de Hodking, virus Epstein Barr, linfoma de Burkitt/Leucemia GCDFP-15 Citoplasma Hiperplasia de mama, piel GLYPICAN 3 Membrana Carcinoma de hígado HCG Membrana Tumor de células germinales HMB45 (Melanosoma) Citoplasma Melanoma, nevus K:AE1/AE3 Citoplasma Colon, piel, hígado Ki67 Núcleo y perinúcleo Amígdala, esófago MAMOGLOBINA Citoplasma Piel, hiperplasia de mama 23 MELAN-A Citoplasma Piel, glándula adrenal MYOD1 Nuclear Musculo p53 Núcleo Adenoca. de colon, colon, esófago PLAP (placental Alkaline Membrana y citoplasma Placenta Phosphatase) PSA Citoplasma Hiperplasia prostática benigna RECEPTOR DE Núcleo Cérvix, mama PROGESTERONA RECEPTOR Núcleo Cérvix, carcinoma de mama ESTROGENICO s100 Núcleo y citoplasma Apéndice/Colon, piel SINAPTOFISINA Citoplasma Apéndice/ colon TIROGLOBULINA Citoplasma Tiroides TTF-1 Núcleo Tiroides, pulmón VIMENTINA Citoplasma Amígdala, hígado, apéndice/colon WT-1 (Willms Tumor 1) Núcleo Trompa de Fallopio Nota. Información parcial tomada de: Manual de Calidad de Inmunohistoquímica en Anatomía Patológica. (Vaquero M., 2007). 2.5. Cuantificación del resultado inmunohistoquímico Según el protocolo standard se siguió la siguiente pauta general, aunque hay casos específicos en los que los porcentajes y su significado pueden variar (Vaquero M., 2007): 2.5.1. Negativo (-) Total negatividad o menos del 50% de las células “sospechosas” con menor intensidad que el control. 2.5.2. Positividad débil (+/-) Más del 50% de las células “sospechosas” con menor intensidad que el control. 2.5.3. Positivo (+) Más del 50% de las células “sospechosas” con igual o mayor intensidad que el control. El límite de intensidades entre negativo y positividad débil o positivo se hace por comparación con un control interno existente u otro externo ad hoc. 24 III. RESULTADOS Se realizó el estudio inmunocitoquímico de 304 casos (Tabla 2) de pacientes provenientes de los diferentes consultorios clínicos del INEN, entre enero de 2017 y diciembre 2018. Estas fueron muestras de distintas partes del cuerpo tomadas por BAAF o métodos radiológicos en ganglios cervicales, tiroides, hígado, pulmón, retroperitoneo, mediastino, parótida, axila, mama, páncreas, ovario, vesícula biliar, riñón, cérvix, bazo, colédoco, duodeno, etc., y muestras de líquidos corporales como líquidos peritoneales, ascíticos, pleurales y secreciones corporales como aspirados y cepillados bronquiales etc. El diagnóstico de cada caso fue dado de acuerdo a los resultados de los paneles inmunocitoquímicos realizados en los 304 casos estudiados. (Tabla 8) Tabla 8 Diagnóstico por Inmunocitoquímica Diagnóstico por inmunocitoquimica 2017 2018 2017-2018 % Citología positiva con estirpe celular Citología de carcinoma 78 37 115 37.83 Citología de Adenocarcinoma 19 9 28 9.21 Citología de Linfoma 15 1 16 5.26 Citología de Metástasis 35 2 37 12.17 Citología positiva sin estirpe celular Citología positiva para células neoplásicas 33 15 48 15.79 Citología sospechosa Citología sospechosa de malignidad 10 9 19 6.25 Citología Atípica 8 3 11 3.62 Citología negativa Citología de tipo inflamatoria 11 3 14 4.61 Citología negativa para células malignas 13 3 16 5.26 TOTAL 222 82 304 100 Nota. Tomado de: Unidad Funcional de Citopatología del INEN De los 304 casos sospechosos de malignidad (Tabla 8) tuvimos casos que dieron ICQ positiva para diferentes estirpes celulares: 115 (37.83%) carcinomas, 28 (9.21%) 25 adenocarcinomas, 16 (5.26%), linfomas y 37 (12.17%) citologías de metástasis de acuerdo a su estirpe celular primaria. También se obtuvo diagnóstico de 48 casos (15.79%) como citologías positivas para células neoplásicas sin especificar su estirpe celular. En cuanto a citología que no pudieron confirmar positividad, 19 casos (6.25%) se quedaron como sospechosas de malignidad y 11 casos (3.63) como citología atípica. Y por último se descartó la malignidad a 30 casos de los cuales 14 casos (4.61%) salieron como citología inflamatoria y 16 casos (5.26%) como citología negativa para células malignas. Figura 8 Tipos de diagnóstico de acuerdo a la citología 10% 10% 80% citologia positiva citologia sospechosa citologia negativa 26 IV. CONCLUSIONES 4.1 Por lo presentado en este estudio retrospectivo de 304 casos con sospecha de malignidad, pudimos demostrar la eficacia de la Inmunocitoquímica en los frotices citológicos, porque se pudo establecer la positividad en 244 casos (80.26%), la negatividad en 30 casos (9.87%) y 30 casos (9.87%) quedaron como sospechosos de malignidad. (Figura 8) 4.2 Esto demuestra la alta especificidad y sensibilidad de la técnica de ICQ en el diagnóstico diferencial en aquellos frotices citológicos únicos, fijados y decolorados previamente. 4.3 Asimismo, la importancia de la aplicación de esta técnica en este tipo de material citológico es muy relevante para la ayuda clínica al paciente, ya que en muchos casos de ello depende su diagnóstico y tratamiento posterior. 4.4 Otra conclusión también importante es que la citología con diagnóstico inmunocitoquímico también ayuda a los pacientes en otros aspectos: en costo beneficio, en no tener que pasar nuevamente por procesos de exámenes para toma de material citológico muchas veces traumáticos para ellos, y de obtener resultados de diagnóstico precisos en los casos donde la obtención del material citológico es de difícil acceso en el paciente. 27 V. RECOMENDACIONES 5.1 Para la utilización de los frotices citológicos ya teñidas previamente es necesario que hayan estado bien fijadas en alcohol de 75%, ya que se ha encontrado gran dificultad en la inmunocitoquímica para la reacción de los anticuerpos con los antígenos de superficie de membrana en frotices fijados al aire o con alcohol de baja concentración. 5.2 Al hacer los frotices en las láminas, tratar de hacerlos en monocapa, ya que se puede tener una buena cantidad de células, pero si están muy agrupadas no permitirá una mejor visualización de la marcación inmunocitoquímica a nivel celular. 5.3 Asimismo, el frotis homogéneo a lo largo de la extensión de la lámina permite que se puedan marcar varias áreas para la tinción con ICQ de diferentes marcadores tumorales en la misma lámina porta objetos. 5.4 Si se tiene en cuenta la calidad del frotis celular, es necesario que el paciente en lo posible no presente cuadros de infección, por la citología inflamatoria que pueda derivar de ello y que no permite la mejor visualización de las células atípicas o sospechosas de malignidad. 28 VI. REFERENCIAS Alwahaibi, N., Alghallabi, A., Alsinawi, S. y Aldairi, N. (2018). Cytological Smear and Cell Block Versus Tissue Biopsies in the Diagnosis of Malignant Tumours in Non- Gynaecologic Specimens. Ethiopian journal of health sciences, 28(5), pp. 583–588. https://doi.org/10.4314/ejhs.v28i5.9 Arias-Stella, C., Huamanciza, O., León, R. y Arias-Stella, J. (2003). Importancia de la citoquímica como ayuda diagnostica. Patología, 41(2), pp. 71-88. Bibbo, M. (1996). Comprehensive Cytopathology. Cytopreparatory Techniques. Saunders: Philadelphia. Edit. Saunders (W.B) Co LTD. Brahmi, U., Rajwanshi, A., Joshi, K., Ganguly, N., Vohra, H., Gupta, S. y et al. (2001). Role of Immunocytochemistry and DNA flow cytometry in the fine-needle aspiration diagnosis of malignant small round-cell tumors. Diagn Cytopathol, 24(4), pp. 233-239. https://doi.org/10.1002/dc.1050 Dako (2015). 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Alcohol 100% 1 minuto 11. Alcohol 100% 1 minuto 12. Xilol 1 minuto 13. Xilol 1 minuto Nota. Los tiempos puestos arriba son propios del laboratorio y dependen de varios factores: Tipo de material citológico, tiempo de preparación de los reactivos, marca del reactivo etc. Este método está basado en la técnica de preparación de Hematoxilina Eosina de Bibbo,1996. 32 Anexo B. Coloración Papanicolaou aplicado en el INEN. 1. Alcohol 50% 2 minutos 2. Lavado en agua 1 minuto 3. Hematoxilina de Harris 2 – 3 minutos aprox. 4. Lavado en agua 2 minutos 5. Agua ácida 0.5% 10 a 20 segundos 6. Lavado en agua 2 minutos 7. Agua ammoniacal 1 minuto 8. Lavado en agua 2 minutos 9. Alcohol 70% 2 minutos 10. Alcohol 70% 2 minutos 11. Alcohol 70% 2 minutos 12. Alcohol 100% 1 minuto 13. Alcohol 100% 1 minuto 14. Alcohol 100% 1 minuto 15. Xilol 1 minuto 16. Xilol 1 minuto 17. Xilol 1 minuto Nota. Los tiempos puestos arriba son propios del laboratorio y dependen de varios factores: Tipo de material citológico, tiempo de preparación de los reactivos, marca del reactivo etc. Este método está basado en la técnica de preparación de Papanicolaou de Bibbo,1996. 33 Anexo C. Protocolo de Inmunocitoquímica aplicado en el INEN Tipos de muestra: - Bloques celulares (pellet celular o coágulos celulares incluidos en parafina) - Frotis celulares (en láminas para procesamiento) Metodología: - Equipo: Autostainer Link 48 - Cortes de muestras: 3 micras (bloque celular o coágulo) Protocolo de inmunotinción: 1.- Estufado de láminas: 1 hora a 60ºC - sólo para cortes de muestras embebidas en parafina - frotis celulares no requieren estufado. 2.- Hidratación de las láminas en batería de alcoholes: sólo para los extendidos celulares 3.- Recuperación antigénica: 10 min. a 92ºC (extendidos celulares) - 20 min. a 92ºC (block cells, muestras embebidas en parafina) 4.- Bloqueo de peroxidasa endógena: 5min a tº ambiente 5.- Lavado con buffer Tris (Tris-Buffered Saline, ph7.6): 3 lavados de 3min. c/u 6.- Incubar con el anticuerpo primario: 20min tº ambiente 7.- Lavado con buffer Tris (Tris-Buffered Saline, ph7.6): 3 lavados de 3min. c/u tº ambiente 8.- Incubar con linker: 20min tº ambiente (sólo a los anticuerpos que así lo requieran) * 9.- Lavado con buffer Tris (Tris-Buffered Saline, ph7.6): 3 lavados de 3min. c/u tº ambiente 10.- Incubar con Ac 2dario unido a Polímero de dextrano conjugado con HRP: 20min tº ambiente 11.- Lavado con buffer Tris (Tris-Buffered Saline, ph7.6): 3 lavados de 3min. c/u 12.- Incubar con DAB (Diaminobencidina concentrada) cromógeno: 10min tº ambiente 13.- Lavado con buffer Tris (Tris-Buffered Saline, ph7.6): 3 lavados de 3min. c/u tº ambiente 34 14.- Contraste con Hematoxilina: 10 seg. tº ambiente 15.- Lavado con agua corriente: 1 min. tº ambiente 16.- Deshidratar láminas (batería de alcoholes: 90º. 95º, 95º, 100º, 100º, sust. xilol, sust. xilol) 17.- Montaje de láminas con medio de montaje a elección. * (cd138, cd 1ª, receptor de progesterona, ttf-1, wt-1) 35 Anexo D. Manual de Instrucciones DAKO Estos procedimientos utilizados en el Laboratorio están basados en el Manual de Instrucciones DAKO (Folleto Dako, 2015), que utiliza EnVision FLEX +, Mouse, High pH que es un sistema de visualización de muy alta sensibilidad diseñado para su uso en inmunohistoquímica con el Autostainer Link Instruments. Nota. DAKO (Folleto Dako, 2015): P04120ES_001_GV800/2015.05 p. 10/12)